Nature深度|细菌中也有cGAS？哈佛科学家发现发现一大类cGAS/DncV样核苷酸转移酶

撰文丨陶晓花

责编丨迦溆

第二信使在细胞信号转导中起重要作用，它们激活级联系统并快速调控下游反应，常见第二信使分子包括cAMP、cGMP、DAG、IP3、Ca²⁺等。环二核苷酸(Cyclic dinucleotides, CDNs)通过充当核苷酸第二信使而在细菌稳态和毒力中具有重要作用。人类受体STING还将这些细菌CDN感知为病原体相关分子模式(PAMPs) 【1】。有文献报道，错误定位的双链DNA会刺激细胞溶质酶cGAS (cyclic GMP–AMP synthase)合成CDN型化合物2'-5'/3'-5'-cyclic GMP-AMP(2',3'-cGAMP)，2',3'-cGAMP在整个细胞中扩散，激活干扰素基因的受体刺激物(STING)并诱导I型干扰素和NF-κB反应以引发保护性抗病毒免疫【2】。几乎所有细菌门都编码CDNs信号通路，然而，目前所有已知的天然CDNs信号分子仅由嘌呤核苷酸组成【3】，我们对细菌信号核苷酸产物的免疫应答的理解范围也仅限于环状双嘌呤分子。

近日，哈佛医学院的研究人员与合作者在Nature上发表题为Bacterial cGAS-like enzymes synthesize diverse nucleotide signals的文章。此文对细菌信号核苷酸进行了系统的生化筛选，发现了一大类cGAS/DncV样核苷酸转移酶(cGAS/DncV-like nucleotidyltransferases, CD-NTases)，它们同时使用嘌呤和嘧啶核苷酸来合成多样的CDNs。晶体结构分析发现CD-NTases为结构上保守的酶家族，并揭示酶的活性位点在盖状结构中，其指导对嘌呤或嘧啶的选择；此外，研究人员还发现CD-NTase的产物除了CDNs外，还合成一类罕见的环状三核苷酸化合物cAAG；研究人员还证实这些环二核苷酸和环三核苷酸激活不同的宿主受体，进而调节病原体和共生微生物与其动物和植物宿主的相互作用。

研究人员在前期实验中报道了一种系统的方法，阐释了弧菌中的DncV及同源物cGAS中合成的产物多样性(DncV合成3',3'-cGAMP)【4-6】。本文借此方法，在大肠杆菌中发现了一个部分操纵子，其中dncV被功能未知的基因(WP_001593458, 命名为cdnE)取代，并证实CdnE的产物是环UMP-AMP(cUMP-AMP) (见下图)。尽管没有整体序列同源性，但CdnE序列中含潜在的cGAS / DncV样活性催化位点残基(GSYX10DVD)，揭示CdnE可能与cGAS和DncV有共同祖先。因此，研究人员在大肠杆菌中将此重命名为：cGAS / DncV样核苷酸转移酶(cGAS/DncV-like nucleotidyltransferases, CD-NTases)。cdnE之前还有一个编码patatin样磷脂酶的基因capE，证实CapE被cUMP-AMP激活，并确定CapV和CapE特异性的仅由相邻编码的核苷酸转移酶合成的核苷酸激活。CapE的特异性使该途径与3',3'-cGAMP和其他CDNs分离，也解释了cUMP-AMP的进化优势和增加的CDNs多样性。

细菌中环状UMP-AMP生物合成基因簇及其化学结构式

哺乳动物已经发展了一种高级的监测系统，用于检测和启动对细菌产物的免疫反应。小鼠STING以高亲和力结合所有四种环状双链分子(c-di-AMP, c-di-GMP, 3', 3'-cGAMP, 2',3'-cGAMP1)，并在细胞中激活I型干扰素信号传导。而研究人员在实验中发现STING无法在体外识别cUMP-AMP，相比之下，受体RECON (RECON是一种氧化还原酶，可感知细菌环二核苷酸从而促进NF-κB活化)能识别cUMP-AMP而cUMP-AMP抑制RECON功能【7】(见下图)。因此，研究人员鉴定了天然存在的嘌呤-嘧啶杂合CDN的宿主受体，也表明宿主可以通过使用多种受体来调控不同CDNs。

A：细胞内STING报告基因测定(cGAS合成2',3'-cGAMP，DncV合成3',3'-cGAMP，DisA合成c-di-AMP，WspR合成c-di-GMP，CdnE合成cUMP-AMP)；b： RECON的酶活抑制实验

随后，研究人员在生信分析与大规模的正向生物化学筛选时发现：几乎每个细菌门的分类群中都存在CD-NTases。尽管编码完整的活性位点，但并未发现CD-NTase簇的具体功能。于是研究人员选择16种CD-NTases进行深入分析，发现来自Legionella pneumophila (strain 12_4117)(WP_042646516, 此处命名为LpCdnE02)的CD-NTase057主要合成c-di-UMP。而其它代表性的酶产生7种嘌呤、嘧啶和嘌呤-嘧啶杂合CDNs组合，证明了CD-NTase酶合成多种细菌核苷酸信号(见下图)。

CD-NTases酶家族在许多细菌门中广泛存在并形成多种核苷酸产物

值得注意的是，研究人员还从Enterobacter cloacae (strain UCI 50) (WP_032676400, 命名为EcCdnD02)中鉴定了CD-NTase038的主要产物-环三核苷酸(cyclic AMP-AMP-GMP, cAAG)(见下图)。与cUMP-AMP相似，cAAG逃避STING但被RECON识别，说明RECON可能已进化出识别其他细菌或宿主环三核苷酸的能力。此类核苷酸产物的发现揭示CD-NTase酶的活性位点可合成更大的环状寡核苷酸产物，并且宿主免疫受体能够识别细菌环状三核苷酸。最近有文献报道Cas10合成的环状寡腺苷酸是III型CRISPR免疫中的关键信号分子【8-9】。尽管CD-NTase与Cas10没有同源性，但也表明较大的环状寡核苷酸产物在细菌信号传导和宿主识别中可能比预期的更常见。

细菌中环三核苷酸的合成和宿主识别

综上：细菌CD-NTases广泛存在并合成包括嘧啶核苷酸在内的多种CDNs以及其它环状三核苷酸化合物。哺乳动物受体识别多种CD-NTase产物，CD-NTase基因可为某些细菌-真核生物相互作用提供选择性优势。了解CD-NTase基因在细菌生物学和宿主-微生物相互作用中的功能是未来研究的主要挑战。CD-NTase中的单点突变使得其能够掺入嘧啶，且细菌可以通过调节酶特异性来逃避或增强STING信号传导。因此，由原核CD-NTases产生的多种CDNs和相关核苷酸信号分子也为新的生物技术和医疗应用提供了重要的新化合物库。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-019-0953-5

制版人：珂

参考文献

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2. Wu, J. & Chen, Z. J. Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids. Annu. Rev. Immunol. 32, 461–488 (2014).

3. Nelson, J. W. & Breaker, R. R. The lost language of the RNA world. Sci. Signal. 10, eaam8812 (2017).

4. Sun, L., Wu, J., Du, F., Chen, X. & Chen, Z. J. Cyclic GMP–AMP synthase is a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway. Science 339, 786–791 (2013).

5. Kranzusch, P. J. et al. Structure-guided reprogramming of human cGAS dinucleotide linkage specificity. Cell 158, 1011–1021 (2014).

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7. McFarland, A. P. et al. Sensing of bacterial cyclic dinucleotides by the oxidoreductase RECON promotes NF-κB activation and shapes a proinflammatory antibacterial state. Immunity 46, 433–445 (2017).

8. Kazlauskiene, M., Kostiuk, G., Venclovas, Č., Tamulaitis, G. & Siksnys, V. A cyclic oligonucleotide signaling pathway in type III CRISPR–Cas systems. Science 357, 605–609 (2017).

9. Niewoehner, O. et al. Type III CRISPR–Cas systems produce cyclic oligoadenylate second messengers. Nature 548, 543–548 (2017).

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